Evaluación de tres PCR cuantitativas para la detección de leptospiras patógenas en animales domésticos en Nicaragua / Evaluation of three qPCR for the detection of pathogenic leptospires in domestic animals in Nicaragua

Resumen: Introducción. En Nicaragua es necesario estandarizar pruebas moleculares como la PCR en tiempo real (quantitative Polymerase Chain Reaction, qPCR) que mejoren el diagnóstico de leptospirosis en humanos y animales. Objetivo. Evaluar tres qPCR para la detección de leptospiras patógenas en animales domésticos de Nicaragua. Materiales y métodos. Se diseñaron cebadores para la amplificación del gen LipL32 en SYBR Green (SYBR Green-A) y TaqMan, y en otros descritos previamente (SYBR Green-B). Las secuencias de 12 cepas obtenidas de la base de datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI) se alinearon para la búsqueda de sondas y cebadores. La sensibilidad analítica se determinó calculando el equivalente genómico detectable, se utilizaron 18 cepas de referencia para la sensibilidad diagnóstica y 28 controles negativos para la especificidad. Los métodos se aplicaron en 129 muestras de orina de animales domésticos. Resultados. En SYBR Green-A se obtuvo un límite de detección de cuatro equivalentes genómicos; en TaqMan, la sensibilidad fue del 94,4 % (IC95% 81,1-100,0). Con SYBR Green-A, se obtuvo una sensibilidad del 77,8 % (IC95% 55,8-99,8), en tanto que con SYBR Green-B fue del 61,1 % (IC95% 35,8-86,4). En las tres pruebas se logró una especificidad del 100 % (IC95% 98,2-100,0). El 26,4 % de las muestras de animales domésticos fueron positivas con SYBR Green-A y el 6,2 % con SYBR Green-B. Conclusiones. El SYBR Green-A presentó un límite de detección bajo, en tanto que las tres técnicas evaluadas mostraron alta especificidad, en tanto que la TaqMan tuvo la mayor sensibilidad.

Abstract: Introduction: Molecular biology diagnostic methods such as real-time PCR should be used in Nicaragua to improve the diagnosis of leptospirosis in humans and animals. Objective: To evaluate three qPCR methods for pathogenic Leptospira detection in domestic animals. Materials and methods: Real-time PCR primers were designed for the amplification of specific regions from the Lip 32 gene of Leptospira in SYBER Green (SYBER Green-A) and TaqMan, as well in SYBER Green-B as previously published. The sequences of 12 strains obtained from the database of the National Center for Biotechnology Information (NCBI) were aligned to select probes and primers. The analytical sensitivity was determined by calculating the detectable genomic equivalent while 18 pathogenic references strains and 28 negative controls were used to evaluate the sensitivity and specificity of each one of the three sets in 129 urine samples of domestic animals. Results: The detection limit of four genomic equivalents per reaction was obtained from SYBR Green-A. The specificities were 94.4% (95% CI: 81.1-100.0) for TaqMan, 77.8% (95% CI: 55.8-99.8) for SYBR Green-A, while for SYBR Green-B it was 61.1% (95% CI: 35.886.4). In the three tests, we obtained a specificity of 100% (95% CI: 98.2-100.0). In the field samples, 26.4% were positive with SYBR Green-A and 6.1% with SYBR Green-B. Conclusion: SYBR Green-A presented the lowest detection limit while the three techniques under evaluation showed high specificity while TaqMan was the most sensitive.

Identificación de parvovirus canino tipo 2C en cachorros de Nicaragua / Identification of canine parvovirus type 2C in puppies of Nicaragua

RESUMEN Objetivo. Identificar los genotipos de parvovirus canino-circulantes en cachorros en dos municipios de Nicaragua. Materiales y métodos. Se recolectaron muestras por hisopado rectal de 45 cachorros con y sin antecedentes de vacunación, menores de 6 meses de edad, con y sin sintomatología compatible con parvovirosis. Las muestras y dos de las vacunas que se comercializan en Nicaragua (vacuna nº1 y vacuna nº2) fueron analizadas por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) convencional para un producto de ≈630 pb del gen VP2. Además, el producto directo del PCR se secuenciaron en sentido reverso cuatro muestras de campo elegidas aleatoriamente y las dos cepas vacunales. Resultados. El 28.9% (13/45) de las muestras analizadas fueron positivas en PCR. No se encontraron diferencias significativas en la detección por PCR del fragmento de VP2, respecto al estado de vacunación de los animales (p≥0.05). Las cuatro muestras de campo secuenciadas fueron identificadas como genotipo CPV-2C y las dos cepas vacunales se identificaron como genotipo CPV- 2A. Conclusiones. la inferencia evolutiva de las secuencias alineadas de cepas vacunales mostró alta divergencia evolutiva respecto a las cepas de campo, este hallazgo lleva a replantear el tema sobre la eficacia de las vacunas analizadas en este trabajo y que son aplicadas en Nicaragua.

ABSTRACT Objective. To identify genotypes of canine parvovirus circulating in puppies in two municipalities of Nicaragua. Materials and methods. Rectal swab samples were collected from 45 puppies (less than 6 months of age) with or without a vaccination history, showing or not symptomatology compatible with parvovirosis. The samples and two of the vaccines that are marketed in Nicaragua (vaccine nº1 and vaccine nº2) were analyzed by conventional Polymerase Chain Reaction (PCR) to a product of ≈630 bp of the VP2 gene. In addition, four randomly chosen field samples and both vaccine strains were sequenced in reverse sense. Results. 28.9% (13/45) of the analyzed samples were positive by PCR, for the fragment of CPV VP2 gene. No significative difference (p≥0.05) was seen in PCR detection between dogs with or without vaccination history. The four sequenced field samples were identified as CPV-2C genotype while both vaccine strains were identified as CPV-2A genotype. Conclusions. The aligned sequences showed high evolutionary divergence of filed strains with respect to vaccines strains, leading us to rethink the efficacy of the analyzed vaccines which are nowadays commercially available in Nicaragua.